Metoda CRISPR/Cas

Metoda CRISPR/Cas (ang. Clustered Regularly-Interspaced Short Palindromic Repeats, pol. zgrupowane, regularnie rozproszone, krótkie, powtarzające się sekwencje palindromiczne) – metoda inżynierii genetycznej, pozwalająca na manipulacje genomem danego organizmu, a także mechanizm immunologiczny bakterii, na podstawie którego powstała owa metoda.

Historia odkrycia

W 1987 roku japoński naukowiec Yoshizumi Ishino odkrył, że bakterie Escherichia coli posiadają w swoim materiale genetycznym, w ściśle określonym miejscu, kilka powtarzających się sekwencji. Ich funkcję odkryły w 2005 roku trzy niezależnie pracujące zespoły. Okazało się, że jest to genotyp bakteriofagów, co sugerowało, że odkryto jeden z mechanizmów obrony immunologicznej u bakterii[1][2].

W 2012 roku Jennifer Doudna i Emmanuelle Charpentier opublikowały badania wykazujące, że CRISPR-Cas9 można programować za pomocą RNA tak, by modyfikowało DNA. Stało się to jednym z najważniejszych odkryć w historii biologii. W 2020 roku Doudna i Charpentier otrzymały za swoje odkrycie nagrodę Nobla[3].

Mechanizm immunologiczny CRISPR

W organizmie bakterii odcinki CRISPR są krótkimi odcinkami DNA występującymi po kilka i oddzielonymi od siebie innymi odcinkami. Podczas transkrypcji cały odcinek DNA (z odcinkami CRISPR i z tymi pomiędzy) jest przekształcany w matrycowe RNA (mRNA). Potem w obróbce potranskrypcyjnej mRNA jest dzielone na krótsze odcinki crRNA (CRISPR RNA), również zawierające odcinek CRISPR jak i te bez niego. Następnie następuje przyłączenie odcinka tractRNA (transactive CRISPR RNA). Te dwa odcinki tworzą wspólnie nazwę gRNA, które jest sygnaturą (wzorcem) wirusa używanym w mechanizmach obronnych komórki[1].

System CRISPR działa podobnie, jak ludzkie mechanizmy immunologiczne (nabyte). Pozwala bakteriom, które przeżyły atak wirusa, uodpornić się na niego, a w przypadku kolejnego ataku, zareagować szybciej i bardziej wydajnie[4].

Do prawidłowego mechanizmu potrzebne są gRNA, zawierające wzorzec wirusa, oraz enzym z grupy Cas, zdolny do cięcia materiału genetycznego wirusa[1]. W wyniku porównania gRNA z materiałem wirusa, oraz jego bardzo precyzyjnym pocięciu przez enzym, wirus przestaje stanowić zagrożenie. Pozostałe odcinki wirusowego materiału genetycznego są wbudowywane w genom gospodarza w specjalnie przygotowane kasetony[5].

CRISPR jako metoda inżynierii genetycznej

W przypadku metody CRISPR możliwe jest dokonywanie bardzo precyzyjnej edycji genomu docelowej komórki. Jest to poza tym metoda stosunkowo tania, wydajna i prosta w wykonaniu[1]. Jedyne, co jest wymagane przy dokonywaniu transformacji genetycznej, to odpowiednie gRNA oraz zadbanie o dostępność enzymu Cas (najczęściej Cas9) w komórce docelowej.

Warunki, jakie musi spełniać zaprojektowane gRNA to początkowa sekwencja 5'-NGG-3', która jest wykrywana przez enzymy Cas, wspomagająca sekwencja na przeciwległej nici, antysensowna do sgRNA. Spełnienie tych dwóch warunków zapewnia wysoką specyficzność i wydajność dokonywanej transformacji[2][6].

Wyniki badań i modyfikacji przy użyciu metody CRISPR/Cas9

W 2013 roku grupa naukowców z USA udowodniła, że można za pomocą metody CRISPR wyłączyć u myszy jednocześnie 5 różnych genów z wydajnością ok. 80%[7]. W tym samym roku niezależnie pracujące zespoły badawcze doniosły o udanych modyfikacjach roślin, ze szczególnym uwzględnieniem roślin uprawnych[8][9].

W połowie 2015 roku naukowcy z Wielkiej Brytanii, Francji i Włoch przeprowadzili udaną modyfikację genetyczną komarów w taki sposób, aby uzyskać w rezultacie bezpłodność u samic. Badania miały za cel stworzenie narzędzia do walki z malarią, co doprowadziłoby do znacznego ograniczenia populacji gatunku komarów będących wektorem dla zarodźców malarycznych i mogłoby znacznie obniżyć zachorowalność na nią, lub nawet doprowadzić do całkowitej eradykacji[10].

Także w 2015 roku doszło, przy pomocy metody CRISPR do udanej modyfikacji ludzkich komórek pierwotnych[11].

Na początku 2016 roku grupa naukowców z Chin jako pierwsza podjęła się użycia metody CRISPR na ludzkich embrionach, jako element leczenia złośliwego raka płuc. Głównym celem było zwiększenie zdolności komórek układu autoimmunologicznego do samodzielnej eliminacji szkodliwego nowotworu[12]. Jednak na początku 2017 roku amerykańscy naukowcy zapowiedzieli dokonanie u siebie pierwszych prób klinicznych, po tym jak Chińczycy ogłosili, że stan pacjenta po podaniu zmodyfikowanych komórek poprawia się. Pierwsze próby w USA są planowane na początek 2017 roku. Badania te zostaną sfinansowane przez Seana Parkera i odbędą się w instytucie nazwanym od jego imienia[13].

W styczniu 2017 grupa naukowców z USA, Chin i Francji przy użyciu metody CRISPR/Cas9 otrzymała bakterie (w tym przypadku E. coli), które miały wszczepiony materiał genetyczny od początku do końca zaprojektowany przez naukowców – a nie przeniesiony z innego organizmu, w którym występuje[14].

W czerwcu 2018 naukowcy z Uniwersytetu Kalifornijskiego w Berkeley opublikowali pracę wykorzystującą metodę CRISPR/Cas9 do leczenia osób z łamliwym chromosomem X. Wykorzystali oni jony złota jako nośnik dla enzymu tnącego DNA i przetransportowali go do mózgu. Jego celem była edycja genów dla receptora neuroprzekaźnika i zmniejszenie dzięki temu zachowań charakterystycznych dla tego zespołu[15].

W listopadzie 2018 media poinformowały o narodzinach pierwszych bliźniąt z genami zmodyfikowanymi dzięki wykorzystaniu metody CRISPR/Cas9[16]. Jak ogłosił wówczas autor eksperymentu prof. He Jiankui, biofizyk z Południowego Uniwersytetu Nauki i Technologii w Shenzhen (Chiny), modyfikacja miała polegać na usunięciu genu CCR5 u embrionów uzyskanych dzięki zapłodnieniu in vitro, by uodpornić je na zakażenie wirusem HIV. W kontrowersyjnym eksperymencie miało wziąć udział 8 par ochotników; w każdej z nich kobieta była zdrowa, a mężczyzna był nosicielem HIV. Eksperyment spotkał się z krytyką środowiska medycznego, a od badań naukowca odcięła się chińska uczelnia, na której jest zatrudniony. Na dokonanie eksperymentu nie ma jednak dowodów naukowych; projekt badawczy był ściśle tajny, nie ujawniono także danych jego uczestników[17].

Przypisy

  1. ↑ a b c d Czym jest CRISPR?, Augmentyka, 31 stycznia 2016 [dostęp 2020-11-25].
  2. ↑ a b t, Nowe zastosowanie CRISPR-Cas9, dolinabiotechnologiczna.pl [dostęp 2016-12-10] [zarchiwizowane z adresu 2017-02-09].
  3. ↑ Pioneers of revolutionary CRISPR gene editing win chemistry Nobel, Nature, 7 października 2020 [dostęp 2020-10-07] (ang.).
  4. ↑ Rodolphe Barrangou i inni, CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes, „Science”, 315 (5819), 2007, s. 1709–1712, DOI: 10.1126/science.1138140, PMID: 17379808 (ang.).c?
  5. ↑ Roman Krzysztof Górecki, Jacek K. Bardowski, Molekularne mechanizmy oporności bakterii kwasu mlekowego na bakteriofagi, „ResearchGate”, 4, 1 października 2011, ISSN 0079-4252 [dostęp 2016-12-10].
  6. ↑ David A. Nelles i inni, Programmable RNA Tracking in Live Cells with CRISPR/Cas9, „Cell”, 165 (2), 2016, s. 488–496, DOI: 10.1016/j.cell.2016.02.054, PMID: 26997482, PMCID: PMC4826288 (ang.).c?
  7. ↑ One-Step Generation of Mice Carrying Mutations in Multiple Genes by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering [dostęp 2016-12-10].
  8. ↑ Qiwei Shan i inni, Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR-Cas system, „Nature Biotechnology”, 31 (8), 2013, s. 686–688, DOI: 10.1038/nbt.2650, PMID: 23929338 (ang.).
  9. ↑ Wenzhi Jiang i inni, Demonstration of CRISPR/Cas9/sgRNA-mediated targeted gene modification in Arabidopsis, tobacco, sorghum and rice, „Nucleic Acids Research”, 41 (20), 2013, e188–e188, DOI: 10.1093/nar/gkt780, PMID: 23999092, PMCID: PMC3814374 (ang.).
  10. ↑ Andrew Hammond i inni, A CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae, „Nature Biotechnology”, 34 (1), 2016, s. 78–83, DOI: 10.1038/nbt.3439, PMID: 26641531, PMCID: PMC4913862 (ang.).
  11. ↑ Ayal Hendel i inni, Chemically modified guide RNAs enhance CRISPR-Cas genome editing in human primary cells, „Nature Biotechnology”, 33 (9), 2015, s. 985–989, DOI: 10.1038/nbt.3290, PMID: 26121415, PMCID: PMC4729442 (ang.).
  12. ↑ David Cyranoski, CRISPR gene-editing tested in a person for the first time, „Nature”, 539 (7630), 2016, s. 479, DOI: 10.1038/nature.2016.20988, PMID: 27882996 (ang.).c?
  13. ↑ China Has Launched the First-Ever CRISPR Gene-Editing Trial in Humans, Fortune, 15 listopada 2016 [dostęp 2016-12-10].
  14. ↑ Extra letters added to life's genetic code, „BBC News”, 24 stycznia 2017 [dostęp 2017-01-30] (ang.).
  15. ↑ Bumwhee Lee i inni, Nanoparticle delivery of CRISPR into the brain rescues a mouse model of fragile X syndrome from exaggerated repetitive behaviours, „Nature Biomedical Engineering”, 2 (7), 2018, s. 497–507, DOI: 10.1038/s41551-018-0252-8, PMID: 30948824, PMCID: PMC6544395 (ang.).
  16. ↑ CRISPR/Cas9, czyli oszukać przeznaczenie. Na co pozwala inżynieria genetyczna?, In Vitro Online, 7 stycznia 2019 [dostęp 2019-02-14].
  17. ↑ Na świat przyszły pierwsze zmodyfikowane genetycznie dzieci. Co to oznacza dla przyszłości inżynierii genetycznej?, Chcemy Być Rodzicami, 7 stycznia 2019 [dostęp 2019-02-14].